爱尔兰淀粉总量检测试剂盒 库存号：D408995 爱尔兰淀粉总量检测试剂盒 库存号：D408995 爱尔兰淀粉总量检测试剂盒 型号:k-tsta-100a库号：D408995
淀粉总量检测试剂盒 (α- /淀粉葡萄糖苷酶) 说明书 K-TSTA-100A 02/22 100 个测试/盒 AOAC Method 996.11 AACC Method 76-13.01 (and improvements) 引言 淀粉大致包含两种成分，直链淀粉主要是通过α-1,4-糖苷键连接的 D-葡聚糖， 含有极少的 α-1,6 支链；而支链淀粉中葡萄糖分子之间除了以 α-1,4-糖苷键相连 外，还有以 α-1,6-糖苷键相连的分支结构。淀粉的酶解法主要是将淀粉置于高温 下，通过耐热α-进行糊化，以产生一系列直链和支链糊精，随后用淀粉葡 糖苷酶（AMG）定量水解为葡萄糖。在 ATP 和 NADP+ 存在下，使用葡萄糖氧 化酶/过氧化物酶 (GOPOD) 试剂或己糖激酶/磷酸葡萄糖脱氢酶检测释放的葡 萄糖。在一系列成功研究的基础上，该方法被采用为 AOAC 方法 996.11、AACC 方法 76-13.01 和 ICC 方法 168。 本试剂盒在 AOAC 方法 996.11 的基础上进行了适当的化，从而提供了一个 加方便用户的淀粉检测方法，即快速总淀粉检测法(RTS)(图 1)[程序(a)]。 图 1 快速总淀粉检测法(RTS) [程序(a)] 本试剂盒可用来检测各种食品、饲料、植物和谷物产品（天然或加工）中的总淀 粉含量。对于大多数样品（例如小麦粉），在耐热 α-存在的情况下，淀粉 能在约 100 ℃的孵育过程中溶解。含有高水平抗性淀粉（例如高直链玉米淀 粉）的样品则需要在 1.7 M 的冷 NaOH 或热的 DMSO 中预溶解。对于仅含有可 溶性淀粉或麦芽糊精的样品，不需要用耐热α-进行孵育。 反应原理 耐热 α-将淀粉水解成可溶性的带支链/不带支链的麦芽糖糊精 (1)。 必要时，可通过用冷的 1.7 M NaOH 搅拌来预溶解样品中的抗性淀粉，然后用乙 酸钠缓冲液中和，用 α-水解(2)。 另外，在 100°C 的 DMSO 中进行溶解也是的方法。 淀粉葡萄糖苷酶 (AMG) 可将麦芽糊精定量水解为 D-葡萄糖 (3)。 D -葡萄糖氧化为 D -葡萄糖酸，释放等摩尔量的过氧化氢(H2O2)，该反应在含过 氧化物酶和醌亚胺染料的比色反应中可定量检测（4, 5）。 单个样品的分析可以在 70 分钟内完成，20 个样品可以在 2 小时内完成。 特异性、灵敏度、线性和度 该试剂盒对 α-葡聚糖（包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麦芽糊精）具有特异 性。 该试剂盒的小吸光度差异为 0.010 单位。 根据推荐的总淀粉 (RTS) 方法，使 用 100 mg 的样品重量和 10.2 mL 的提取体积，这相当于约 0.09 g/100 g 的总 淀粉含量。检出限为 0.18 g/100 g 总淀粉，即样品质量为 100 mg，提取体积为 10.2 mL 时，吸光度差异为 0.020。该方法在每次检测 4-100 μg D -葡萄糖范围内 时呈线性关系。 干扰 如果 D-葡萄糖的转化在测试规定的时间内（约 20 分钟）完成，一般可以认为 没有发生干扰。 试剂盒 Megazyme 提供对总淀粉含量进行 50/100 次检测的试剂盒。该试剂盒包含完整 的检测方法以及： 瓶 1：耐热 α-（Megazyme 货号：E-BSTAA。pH 6.5，40°C，3,000 U/mL； pH 5.0，40°C，3,000 U/mL），在 4°C 下可稳定储存 4 年以上，在-10°C 下可稳定 保存 10 年以上。 K-TSTA-50A: 5 mL K-TSTA-100A: 10 mL 瓶 2：淀粉葡萄糖苷酶（Megazyme 货号：E-AMGDF。pH 4.5，40°C 时，底物为 可溶性，酶活为3300 U/mL；底物为对硝基苯-β-麦芽糖苷，酶活为200 U/mL）， 在 4°C 下可稳定储存 4 年以上，在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。 K-TSTA-50A: 5 mL K-TSTA-100A: 10 mL 瓶 3：GOPOD 试剂缓冲液。缓冲液（50 mL，pH 7.4），含对羟基和 钠（0.09% w/v）。在 4°C 下可稳定储存 4 年以上。 瓶 4：GOPOD 试剂酶。含葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和 4-氨基。冻干 粉。在-10°C 下可稳定保存 4 年以上。 瓶 5：D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶剂为 0.2% (w/v) 。室温 保存，可稳定保存 5 年以上。 瓶 6：标准化常规玉米淀粉质控样。小瓶标签上显示的是淀粉含量。室温保存， 可稳定保存 5 年以上。 A. 试剂/悬液的制备： 1. 使用提供的瓶 1 中的内容物。该溶液是粘性的，因此应该用容积式分配器进 行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸头 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S （用于移取 0.1 mL 的试样）。 在 4°C 下可稳定储存 4 年以上。 在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。 注：如果使用者参考 AOAC 方法 996.11（方法 c），请用含 5 mM 氯化钙的 MOPS 缓冲液（50 mM，pH 7.0）[B(e)]将瓶 1 的内容物稀释 30 倍后再使用。 2. 使用提供的瓶 2 中的内容物。该溶液是粘性的，因此应该用容积式分配器进 行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸头 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S （用于移取 0.1 mL 的试样）。 在 4°C 下可稳定储存 4 年以上。 在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。 3. 将瓶 3（GOPOD 试剂缓冲液）用去离子水定容至 1L，配制完成后立即使用。 注：（1）储存时，浓缩缓冲液中可能会形成盐晶体。当该缓冲液用去离子水稀释至 1L 时，它们溶解。 （2）该缓冲液含有 0.09% (w/v) 。这是一种有毒化学品，配制时请做好防 护。 4. 先将瓶 4 中的内容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再将其和剩余的溶液 3 混匀。 用铝箔纸将试剂瓶包裹以避光放置。此试剂称之为为葡萄糖测定试剂(GOPOD Reagent)。在 2-5°C 下可稳定储存约 3 个月。在-10°C 下可稳定保存 12 个月以上。 注：（1）如果该试剂以冷冻状态储存，好将其分装为约 200 mL 的等分试样，在使用 过程中仅冷冻/解冻一次。 （2）新配制的试剂可能呈淡黄色或淡粉色。在 4°C 储存的 2-3 个月内，溶液颜色会逐 渐转变为深粉红色。以去离子水为背景时，该溶液的吸光度应小于 0.05。 5＆6. 瓶 5、瓶 6 中的内容物可直接使用。室温保存，可稳定保存 5 年以上。 B. 试剂配制（本试剂盒不提供） 试剂 1 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液 (100mM，pH 5.0) 将 5.8mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸馏水中。通过添加 1M (4g/100mL) 溶液（需要大约 30mL）将 pH 值调节至 5.0。加入 0.74g 二水氯化钙并 溶解。定容至 1L，将该缓冲液储存于 4°C，在 4°C 下可稳定储存 6 个月以上。 试剂 2 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液 (200mM，pH 4.5) 将 11.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸馏水中。通过添加 1M (4g/100mL) 溶液（需要大约 60mL）将 pH 值调节至 4.5。加入 0.74g 二水氯化钙并 溶解。定容至 1L，将该缓冲液储存于 4°C，在 4°C 下可稳定储存 6 个月以上。 试剂 3 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液 (600mM，pH 3.8) 将 69.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 1600mL 蒸馏水中。通过添加 4M （16g/100mL)溶液将 pH 值调节至 3.8。加入 1.48g 二水氯化钙并溶解。 定容至 2L。该缓冲液可在室温下稳定储存 12 个月以上。 试剂 4 NaOH 溶液 (1.7M) 将 68g NaOH 添加到 900mL 去离子水中并搅拌溶解，定容至 1L。储存在密封容 器中。在室温下可稳定储存 2 年以上。 试剂 5 含氯化钙（5mM）和（0.02%w/v）的 MOPS 缓冲液 (50mM， pH 7.0) 可选：仅当使用程序 (c) 和 (d) 分析样品时才需要。 将 11.55g MOPS（钠盐，Sigma 目录号 M9381）溶解在 900mL 蒸馏水中，通过 添加 1M (10%v/v) HCl（需要约 17mL）将 pH 值调节至 7.0。加入 0.74 克二水氯 化钙和 0.2 克并溶解。定容至 1L。将该缓冲液储存于 4°C，在 4°C 下可 稳定储存 6 个月以上。 注意:待 pH 值调整完成后再加。酸化时会释放出有毒气体。 试剂 6 乙醇（50%和 80% v/v） 50%v/v：将 500mL 乙醇(95%v/v)添加到 500mL 蒸馏水中。 80%v/v：将 800mL 乙醇(95%v/v)添加到 200mL 蒸馏水中。 将各试剂储存在 1L 试剂瓶中。在室温下可稳定储存 4 年以上。 C. 需要的设备 1. 研磨机 2. 离心机（4000rpm） 3. 微量离心管（13000rpm） 4. 分光光度计，能够在 510 nm（10 mm 路径长度）下运行 5. 分析天平 6. 恒温水浴锅（50℃） 7. 沸水浴锅（配有试管架） 8. 磁力搅拌器 9. 涡旋搅拌器 10. 移液器/移液枪 11. 容积式移液器（如 Brand HandyStep® S） 12. 一次性离心管（13mL, 101×16.5mm） 13. 一次性微量离心管（2.0mL） 14. 玻璃试管（14mL, 16×100mm） 15. 康宁培养管（16 x 120 mm, 带螺帽） 16. 塑料“午餐盒"（足够容纳试管架，作冰水浴用） D. 控制和预防措施 a. 与 GOPOD 试剂进行孵育的时间并不重要，但应至少为 20 分钟，并在显色反 应 60 分钟内进行吸光度检测。 b. 每组检测都应包括空白试剂和葡萄糖标准品对照（100 μg，一式四份）。葡萄 糖-GOPOD 的标准曲线应具有线性。 i)空白试剂：0.1 mL 蒸馏水+ 3.0 mL GOPOD 试剂。 ii)葡萄糖标准品：0.1 mL 葡萄糖标准溶液 (100 μg/0.1 mL) +3.0 mL GOPOD 试 剂。系数因子“F"（第 15 和 16 页）的计算方法是将分析的 D-葡萄糖质量（100 μg）除以其在检测中得到的吸光度结果（例如 100/1.038 = 96.386）。每次检测所 得到的吸光度值可能会有所不同。 c. 对于每一次检测，都应包括标准面粉或淀粉样品。 d. 对于每新批次的 GOPOD 试剂，每 100 μg 葡萄糖标准品反应达到终点时所需 时间大约为 15 分钟（通过显色效果来判断反应是否到达终点）。 加包装3KG
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